Belangrijke ontwerpoverwegingen voor onderzoeksprotocollen voor validatie van virale klaring van gentherapieproducten

ICH Q5A(R2)-Internationale Harmonisatiestichting

ICH Q5A(R2) werd officieel aangenomen op 1 november 2023 en vertegenwoordigt het belangrijkste internationale richtsnoer voor de evaluatie van de virale veiligheid. Vergeleken met Q5A(R1), gepubliceerd in 1999, omvatten de belangrijke updates in de R2-versie: een nieuw toegevoegd hoofdstuk over virale veiligheidsevaluatie bij continue productie (hoofdstuk 7); een versterkte rol van risicobeoordeling als basis voor strategieën voor virusklaring; integratie van sequencing van de volgende-generatie (NGS) in overwegingen voor virale detectie; en expliciete eisen voor de evaluatie van nieuwe producten en productieprocessen. Q5A(R2) is goedgekeurd door regelgevende instanties, waaronder de FDA, EMA en PMDA, en biedt een uniform technisch raamwerk voor de validatie van virale klaring wereldwijd.

NMPA-Chinees regelgevingssysteem

Het NMPA-regelgevingskader voor virale veiligheid omvat meerdere niveaus:

Documentniveau	Documentnaam	Jaar van uitgifte
Fundamenteel document	Technische richtlijnen voor het verwijderen/inactiveren van virussen uit bloedproducten	2002
Fundamenteel document	Algemene principes voor technische beoordeling van virale veiligheidsevaluatie van biologisch weefsel-Afgeleide producten en eukaryotische cellen-Uitgedrukte producten	2005
Product-specifieke richtlijn	Technische richtlijnen voor farmaceutisch onderzoek en evaluatie van klinische proefaanvragen voor recombinante adeno-Associated Virus (rAAV) Vector-gebaseerde in vivo gentherapieproducten	2023
Product-specifieke richtlijn	Algemene technische vereisten voor de farmaceutische kwaliteit van recombinante adeno-Associated Virus (rAAV) Vector-gebaseerde in vivo gentherapieproducten voor vergunningsaanvragen voor het in de handel brengen	2025
Innovatieve richtlijn	Technische richtlijnen voor platformvalidatie van virale klaringsprocessen voor klinische proeftoepassingen van therapeutische recombinante eiwitproducten (proef)a	2024

a: Deze richtlijn vertegenwoordigt de eerste keer dat de Chinese regelgevende instantie systematische technische vereisten heeft vastgelegd voor platformvalidatie van virale klaringsprocessen, en is in lijn met de geest van ICH Q5A(R2).

FDA en EMA-Amerikaanse en Europese regelgevingsvereisten

De FDA heeft in januari 2024 formeel een sectorrichtlijn uitgegeven op basis van ICH Q5A(R2). Daarnaast heeft het hoofdstuk United States Pharmacopeia (USP)<1050.1>biedt aanvullende technische richtlijnen voor het ontwerp, de evaluatie en de karakterisering van virale klaringsprocedures. De FDA organiseert elke twee jaar een Viral Clearance Symposium; het symposium van 2023 behandelde baanbrekende-onderwerpen zoals nieuwe modaliteiten, continue productie, nieuwe chromatografiemedia en adsorptiefilters. Tot de kerndocumenten van het EMA behoren CPMP/BWP/268/95 (Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses) en EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Guideline on Virus Safety Evaluation of Biotechnological Investigational Medicinal Products), die beide zijn geharmoniseerd met de ICH Q5A(R2).

Identificatie van bronnen van virale besmetting

ICH Q5A(R2) benadrukt dat het ontwerp van de validatie van de virale klaring gebaseerd moet zijn op een uitgebreide risicobeoordeling. Voor gentherapieproducten moet bij de identificatie van bronnen van virale besmetting de volgende niveaus worden aangepakt:

Celbankniveau: endogene virussen (bijv. retrovirale deeltjes) en latent infectieuze virussen die mogelijk aanwezig zijn in de productiecelsubstraten (bijv. HEK293, CHO, HeLa). Het is bekend dat HEK293-cellen endogene Ad5 El-sequenties en een EBV-fragment van ongeveer 900 bp bevatten, en in staat zijn replicatie-competent adenovirus tot expressie te brengen; daarom moet bij de risicobeoordeling bijzondere aandacht aan dit risico worden besteed.

Helpervirusniveau: Bij de productie van AAV-vectoren worden doorgaans methoden gebruikt zoals drievoudige transfectie met behulp van helperplasmiden, die het risico met zich meebrengen dat er replicatie-competent adenovirus (RCA) ontstaat. Op dezelfde manier kunnen verpakkingscellen die worden gebruikt bij de productie van lentivirale vectoren replicatie-competent lentivirus (RCL) genereren.

Grondstoffenniveau: Onvoorziene virussen kunnen worden geïntroduceerd via grondstoffen die bij de productie worden gebruikt, waaronder celkweekmedia, voer en enzymen. Dit risico is vooral groot als er dierlijke- componenten worden gebruikt (bijvoorbeeld foetaal runderserum, trypsine-digestoplossingen).

Risicoverschillen: gentherapie versus traditionele recombinante eiwitten

Risicodimensie	Traditionele recombinante eiwitproducten	Producten voor gentherapie
Virale bron	Endogene virussen uit celbank; adventieve virussen	Celbankvirussen; helpervirussen; replicatie-competente vectoren (RCV/RCL); gastheergenoomintegratie
Celsubstraat	CHO, NS0, Sp2/0 en andere goed-gekarakteriseerde cellijnen	HEK293, HeLa, CHO, enz.; sommige cellijnen zijn van tumorgene oorsprong
Producteigenschappen	Geneesmiddel op basis van eiwitten-; goed-gedefinieerde structuur	Virale vector; brengt bioveiligheidsrisico's met zich mee
Validatie strategie	Virale klaring in meerdere- stappen; nadruk op processtapvalidatie	RCV/RCL-detectie vereist; validatie en testen zijn beide essentieel
Platformvalidatie	Toepasbaar op gevestigde processen zoals S/D, lage pH, nanofiltratie	Beperkte toepasbaarheid vanwege diversiteit aan vectortypen

Tabel 1. Vergelijking van virale veiligheidsrisico's: gentherapieproducten versus traditionele recombinante eiwitproducten

Algemene principes

Selectie van indicatorvirussen is een centraal element in het ontwerp van validatieprotocollen voor virale klaring. ICH Q5A(R2) vereist dat de selectie van indicatorvirussen gebaseerd is op de risicobeoordeling en rekening houdt met de volgende factoren:

Relevantie van het virus voor het productiecelsubstraat (relevant virus)

Fysisch-chemische eigenschappen van het virus (omhuld/niet-omhuld, DNA/RNA, groottebereik)

Resistentie van het virus tegen fysisch/chemische behandelingen

Detecteerbaarheid en bioveiligheid van het virus

Voor gentherapieproducten moet bij de selectie van indicatorvirussen bovendien rekening worden gehouden met: de rol van het vectorvirus zelf als een "relevant virus"; het potentiële risico van besmetting met een helpervirus; en de detectie- en validatievereisten voor replicatie-competente virussen (RCV/RCL).

Aanbevolen indicatorviruspaneel

Virus	Type	Envelop	Genoom	Grootte (nm)	Selectiegrondslag / toepassing
MVM	Parvovirus	Geen	ssDNA	18–26	Niet-omhuld model; kleinste maat en hoogste weerstand; geschikt voor nanofiltratievalidatie (in het algemeen niet toepasbaar voor rAAV-vectorproducten)
PPV	Parvovirus	Geen	ssDNA	18–26	Niet-omhuld model; veelgebruikt indicatorvirus voor bloedproducten
Reo-3	Reovirus	Geen	dsRNA	60–80	Niet-omhuld model; middelgroot; hoge fysieke stabiliteit
PRV	Herpesviridae	Ja	dsDNA	150–200	Omhuld model; groot formaat; breed gastheerbereik
X-MuLV	Retrovirus	Ja	ssRNA	80–110	Omhuld retrovirusmodel; geschikt voor CHO-afgeleide celsubstraten
BVDV	Flaviviridae	Ja	ssRNA	40–60	Omhuld model; gebruikt om chemische inactiveringsmethoden te evalueren (HCV-surrogaat)
VSV	Rhabdoviridae	Ja	ssRNA	70	Omhuld model; brede pH-tolerantie; geschikt voor inactivatievalidatie bij lage-pH

Tabel 2. Aanbevolen indicatorviruspanel voor validatie van de virale klaring van gentherapieproducten

Speciale overwegingen voor AAV Vector-producten

Voor recombinante AAV-vectorproducten vereisen de NMPA Technical Guidelines for Pharmaceutical Research and Evaluation of Clinical Trial Applications for rAAV Vector-Based In Vivo Gen Therapy Products aandacht voor de detectie van replicatie-competente AAV (rcAAV). rcAAV verwijst naar AAV dat in staat is tot autonome replicatie, wat doorgaans voortkomt uit homologe recombinatie tussen het helperplasmide en het product-AAV-genoom. Detectie van rcAAV wordt over het algemeen uitgevoerd met behulp van infectietests of qPCR-methoden, die afzonderlijk worden uitgevoerd op de geneesmiddelsubstantie en het gezuiverde product.

Het is vermeldenswaard dat stroomafwaartse zuiveringsprocessen voor AAV-vectorproducten doorgaans nucleasedigestie, chromatografie (AEX), nanofiltratie en ionenuitwisselingschromatografie (CEX/IEX) omvatten. Bij traditionele validatie van virale klaring kunnen deze processtappen resulteren in aanzienlijke verliezen van de AAV-vector zelf; daarom moet de interactie tussen de vector- en indicatorvirussen zorgvuldig worden overwogen tijdens het ontwerpen van -down-modellen. Voor bepaalde processtappen (bijv. nanofiltratie) waarbij AAV-vectorverliezen substantieel zijn, moet worden geëvalueerd of procesaanpassingen gerechtvaardigd zijn op basis van validatiegegevens (bijv. aanpassing van de poriegrootte van het nanofiltratiemembraan).

Algemene principes

Het scale-down-model (SDM) is het kerninstrument voor de validatie van de virale klaring; het ontwerp ervan moet de virale klaringsprestaties van het productieproces nauwkeurig weergeven. ICH Q5A(R2), paragraaf 6.2.2, vereist expliciet dat het scale-down-model consistentie behoudt met het productieproces wat betreft belangrijke parameters. Voor gentherapieproducten zijn de volgende overwegingen vooral belangrijk bij het ontwerpen van SDM:

Representativiteit van kritische procesparameters

Het schaal--downmodel moet consistent zijn met het productieproces wat betreft de volgende parameters: chromatografische omstandigheden (buffersamenstelling, pH, geleidbaarheid); beladingsverhouding (massaverhouding vector/supernatant eiwit); contacttijd en temperatuur; stroomsnelheid/verblijftijd; zuiverheid en samenstelling van het product. Voor AAV-producten moet ook specifiek aandacht worden besteed aan het effect van de vectordeeltjesgrootteverdeling en het lege capsidegehalte op de nanofiltratieprestaties.

Modelkwalificatievereisten

ICH Q5A(R2) vereist een adequate kwalificatie van het scale-down-model, inclusief: vergelijking van productkwaliteitskenmerken (bijvoorbeeld zuiverheid, herstel, dichtheid); kwalificatie van de consistentie van kritische procesparameters; en ervoor zorgen dat het schaal-model de procesvariabiliteit van het productieproces vastlegt. Voor chromatografiestappen moet de consistentie van piekprofiel, elutie en wasbehandeling worden gekwalificeerd; voor nanofiltratiestappen moeten de effecten van volumecapaciteit en productsamenstelling worden geverifieerd.

LRV-berekeningsformule

De logreductiewaarde (LRV) is de kernmaatstaf voor het meten van de effectiviteit van de virale klaring. ICH Q5A(R2), paragraaf 6.5, geeft een gedetailleerde beschrijving van de LRV-berekeningsmethoden en statistische behandeling. De basisformule voor de berekening van de LRV is: LRV=log₁₀(N₀/N), waarbij N₀ de initiële virustiter is na virusspiking en N de resterende virustiter na procesbehandeling. Wanneer de resterende virustiter onder de detectielimiet van de test daalt, moeten schattingsmethoden zoals de Poisson-verdeling worden gebruikt (bijvoorbeeld testen met grote- volumes).

Toepassing van betrouwbaarheidsintervallen

Zowel ICH Q5A(R2) als EMA CPMP/BWP/268/95 vereisen een beoordeling van het betrouwbaarheidsinterval van de resultaten van de LRV-berekeningen. Meestal wordt een betrouwbaarheidsinterval van 95% toegepast.

Criteria voor effectiviteit

Volgens de technische richtlijnen van de NMPA voor het verwijderen/inactiveren van virussen uit bloedproducten geeft een virusreductie van meer dan of gelijk aan 4 logs aan dat de processtap effectief is voor het verwijderen/inactiveren van virussen. Dit criterium is echter geen absolute drempel en moet op een holistische manier worden geëvalueerd, samen met de inactiveringskinetiekcurven, de wetenschappelijke onderbouwing voor de selectie van indicatorvirussen en de algehele deugdelijkheid van het ontwerp van het validatieprotocol. Voor gentherapieproducten moet speciale aandacht worden besteed aan de cumulatieve klaringscapaciteit in alle processtappen om ervoor te zorgen dat het algehele virale veiligheidsprofiel op een acceptabel niveau ligt.

Toepassing en uitdagingen van nanofiltratie

Virus{0}}retentieve filtratie (nanofiltratie) is een cruciale stap voor het opruimen van virussen in de stroomafwaartse zuivering van gentherapieproducten. Typische virus-retentieve filters hebben een poriegrootte van ongeveer 20 nm. Het virale klaringsmechanisme van nanofiltratie is hoofdzakelijk op grootte-gebaseerde uitsluiting, en het kan effectief de meeste virussen verwijderen die groter zijn dan de membraanporiegrootte, inclusief niet-omhulde kleine parvovirussen zoals MVM en PPV.

Nanofiltratie voor gentherapieproducten staat echter voor unieke uitdagingen: de grootte van AAV-vectoren (ongeveer 20–26 nm) is vergelijkbaar met die van bepaalde indicatorvirussen (bijv. MVM, 18–26 nm), wat kan resulteren in verminderd vectorherstel; lege capsiden kunnen de filtratieflux en de efficiëntie van virale retentie beïnvloeden; De viscositeit van het monster kan aanzienlijk toenemen met de vectorconcentratie. Daarom moet bij het SDM-ontwerp voor de validatie van nanofiltratie volledig rekening worden gehouden met de effecten van de vectordeeltjesgrootteverdeling en het lege capsidegehalte op de filtratieprestaties, en moet worden overwogen om indien nodig nanofiltratiemembranen met grotere poriegroottes te gebruiken.

Evaluatie van virale klaring van chromatografiestappen

Ionenuitwisselingschromatografie (IEX) is een kernstap in de zuiveringsprocessen van AAV-producten, waarbij doorgaans gebruik wordt gemaakt van nucleasedigestie gevolgd door anionenuitwisselingschromatografie (AEX) om lege en defecte capsiden te vangen, of kationenuitwisselingschromatografie (CEX) voor fijne zuivering van volledige capsiden. Virale klaringsmechanismen bij chromatografiestappen omvatten uitsluiting van grootte, elektrostatische interacties, affiniteitsinteracties en andere factoren. Discussies op het FDA 2023 Viral Clearance Symposium benadrukten dat de effectiviteit van virale klaring van chromatografiestappen wordt beïnvloed door meerdere factoren, waaronder laadcapaciteit, pH, geleidbaarheid en harscycli; Voor een alomvattende evaluatie moet een orthogonale ontwerpbenadering met meerdere- factoren worden gevolgd.

Virale veiligheidscontrole bij continue productie

Het nieuw toegevoegde hoofdstuk 7 van ICH Q5A(R2) bevat specifieke vereisten voor de evaluatie van de virale veiligheid bij continue productie. Voor gentherapieproducten is continue productie een belangrijke ontwikkelingsrichting geworden, maar dit brengt ook nieuwe uitdagingen op het gebied van de virale veiligheid met zich mee. Virale veiligheidscontrolestrategieën bij continue productie omvatten: in-line virusbarrièrefilters als kritische inperkingsmaatregelen; passend ontwerp van verblijftijden en processtromen; integratie van inactiveringsstappen met gedefinieerde houdtijden; en verbeterde toepassing van procesanalytische technologie (PAT) voor realtime monitoring van kritische procesparameters.